Zu Lebzeiten Schillers dominierten Männer die politische Welt. Die Frauen mussten sich üblicherweise dem männlichen Geschlecht unterwerfen, was Schiller offenbar als durchaus schwierig empfand. In seinem Trauerspiel zeichnete er daher lebenskräftige Frauengestalten, die letztendlich Opfer des männlichen Herrschaftsverlangens werden.

So findet sich die Tragik von Königin Elisabeth im Missverhältnis zwischen ihrem Amt und ihrer Person. Sie ist sich der großen Verantwortung der Krone bewusst und versucht, alle Regierungspflichten genauso diszipliniert und gut wie ihre männlichen Kollegen zu erfüllen. Elisabeth ist als Königin daher nicht bereit dazu, die traditionell bestimmte weibliche Rolle zu spielen. Sie verweigert eine Heirat und will als Jungfrau sterben, um ihre Freiheit und Macht zu behalten. Dadurch büßt sie allerdings ihre Attraktivität, Sinnlichkeit und Anziehungskraft auf die Männer ein. Außerdem belastet es die Königin, ihre Gefühle ständig unterdrücken zu müssen. Sie ist innerlich unsicher, ist dem Druck der männlich dominierten Welt nicht gewachsen und fühlt sich als eine Art Gefangene ihres Amtes. Aus diesem Gefühl resultiert somit auch der Hass auf Maria Stuart. Diese kann ihre Triebe ausleben, ist das Sinnbild einer Frau und führt somit das Dasein, das Elisabeth als pflichtbewusste Regentin verwehrt bleibt.

Maria Stuart hat es ebensowenig geschafft, eine Synthese von weiblichen Eigenschaften und männlichen Regierungsqualitäten herzustellen. Während Elisabeth die Frau in sich vernachlässigt, vernachlässigt Maria Stuart die Regentin in sich. Zugunsten ihrer Triebe und Gefühle unterwarf sie sich als Königin diversen Männern, ließ sich und ihre Macht ausnutzen. Auch Maria Stuart hat so nicht zu Selbstbestimmung als Frau gefunden.

Schiller nutzte sein Drama außerdem dazu, das Handlungsmuster der höfischen Gesellschaft zu offenbaren und zu kritisieren. Er stellt im Handlungsverlauf dar, dass es einen ständigen Konflikt gibt zwischen Vertrauen und Misstrauen, zwischen Schein und Sein sowie zwischen Öffentlichkeit und Privatheit. So weiß Maria Stuart zum Beispiel nie, wem sie vertrauen kann, wer wirklich auf ihrer Seite steht. Und auch Elisabeth muss immer wieder abwägen, wem sie ihr Vertrauen schenken kann. Das Thema Schein und Sein wird speziell an Elisabeth sichtbar, die nach außen hin selbstbewusst und mächtig wirkt, innerlich aber unsicher und ängstlich ist. Den Konflikt zwischen Öffentlichkeit und Privatheit erleben wiederum beide Königinnen. Ihr Verhalten wird vom ganzen Volk beobachtet und bewertet. Ein richtiges Privatleben können sie nicht führen.

Genaugenommen geht es am Hofe nur darum, andere mit den richtigen Argumenten für sich gewinnen zu können und zu überzeugen. Die Rhetorik spiegelt eine Art sprachliche Kriegsführung wider. Anhand der gemischten Charaktere von Elisabeth und Maria Stuart zeigt Schiller auf, dass mit der richtigen, wirkungsvollen Sprache jeder noch so schlechte Charakter am Hofe verschleiert wird. Er versucht mit seinem Drama insofern auf das Publikum einzuwirken, dass dieses genauer hinschaut und eben nicht in der gängigen Parteilichkeit und Schwarzweißmalerei denkt.

Am Beispiel von Königin Elisabeth versucht Schiller außerdem, die reine Machtpolitik abzuwerten, die ohne Moral auskommen will. Er legt dar, dass diese Realpolitik für Schaden an der Persönlichkeit sorgt. Elisabeth, die nur auf ihre Macht bedacht Maria Stuart hingerichtet sehen will, wird dadurch aber keineswegs ihre Selbstzweifel los, sondern macht sich erst recht Selbstvorwürfe. Die eiskalte, machtpolitische Art schränkt somit genaugenommen Elisabeths Handlungsfreiheit ein. Dabei gilt diese in Schillers Moralverständnis als absolutes Zeichen für Humanität. Maria hat diese humane Autonomie durch ihr moralisches Denken erreicht. Indem sie Buße tut für ihre früheren Vergehen und ihr Schicksal annimmt, verliert sie zwar ihre Macht als Königin, erlangt aber innere Freiheit.

Ein weiterer politischer Aspekt, auf den Schiller anspielt, ist die Thronfolge. Am Beispiel von Elisabeth und Maria macht er deutlich, dass dieses Thema eine große Problematik darstellt. Wer hat nun das Anrecht auf den Thron eines Landes? Kann einen wirklich allein die Geburt dazu befähigen, der Rolle als König bzw. Königin gerecht werden zu können?

Die Religion spielt im Drama eine wichtige Rolle. So besteht die Rivalität zwischen Elisabeth und Maria Stuart unter anderem auch deshalb, weil die eine Protestantin, die andere Katholikin ist. Schiller selbst aber ging es nicht darum, die Religion an sich darzustellen. Obwohl er gerade im letzten Akt viele Praktiken des Katholizismus beschreibt, ist er selbst kein Anhänger der Kirche. Er wollte lediglich die Bildhaftigkeit der religiösen Handlungen und Gegenstände für seine künstlerischen Zwecke nutzen. Etwa, indem er Maria Stuart im weißen Gewand mit einem Kreuz auf das schwarz behängte Schaffot treten lässt.

Dass es Schiller nicht auf die religiöse Bedeutung ankam, zeigt sich auch darin, dass er nach der Kritik an der Beichtszene viele Stellen entschärfte. Melvil hat in der neueren Fassung keine Priestereigenschaft mehr. Das Wort „Gott“ ersetzte er durch „Himmel“, aus der „Beichte“ machte er ein „Bekenntnis“.

Betrachtet man das Drama allerdings trotzdem unter dem religiösen Gesichtspunkt, so kann man sagen, dass Maria, Mortimer und Hanna Kennedy drei verschiedene Seiten des Katholizismus widerspiegeln. Maria ist die Geläuterte, die nach langem Leiden den eigentlichen Wert der Religion erkannt hat. Mortimer als frisch konvertierter Katholik ist voller sinnlicher Begeisterung für die Lehre. Hanna ihrerseits geht es vor allem um die äußeren Praktiken. Ihr ist der Gottesdienst oder die Beichte enorm wichtig.

Das Trauerspiel Maria Stuart kann auch unter dem Gesichtspunkt der Paradoxie interpretiert werden. Elisabeth erscheint zu Beginn der Handlung als die Mächtige, die viele Vertraute und Helfer hat. So erreicht sie schlussendlich auch ihr Ziel: Maria Stuart als Bedrohung loszuwerden, indem diese hingerichtet wird. Paradoxerweise stellt sich dies aber als Fehlschlag heraus. Anstatt freier und mächtiger zu werden, steht Elisabeth nach Marias Hinrichtung gedemütigt und einsam da. Maria dagegen, die anfangs die Gefangene ohne Hoffnung war, triumphiert als Unschuldige, die ihr Schicksal mit offenem Herzen angenommen hat. Sie hat ihren eigenen Fehler erkannt, eine Harmatia erlebt und innere Freiheit erlangt.