Der dritte Aufzug spielt in einem Park, der vorne mit Bäumen bewachsen ist und eine weite Aussicht bietet.

Erster Auftritt

Maria läuft schnell hinter den Bäumen hervor in den Park. Ihre Amme kann ihr so schnell kaum folgen. Doch Maria Stuart ist so entzückt von ihrer neuen Freiheit, dass sie nicht innehalten kann. Sie hofft, dass die Erlaubnis, in den Park zu gehen, ein Schritt in Richtung vollkommener Freiheit ist. Dass Lord Leicester sich für sie einsetzt und sie endlich aus dem Kerker befreit. Hanna Kennedy versucht, diese Hoffnung zu dämmen und der schottischen Königin klar zu machen, dass sie noch immer von Mauern umzäunt ist. Doch Maria ist fest davon überzeugt, dass alles gut wird.

Zweiter Auftritt

Ritter Paulet kommt zu den beiden Frauen hinzu und fordert Maria Stuarts Dank für die Gande, in den Park zu dürfen. Diese reagiert überrascht, dass es sein Werk war und er den Brief an Elisabeth tatsächlich übergeben hat. Daraufhin verkündet Paulet ihr, sie würde außerdem gleich die Königin treffen, da diese in der Gegend jage. Maria Stuart erschrickt und klagt: „O warum hat man mich nicht vorbereitet! (...) Was ich mir als die höchste Gunst erbeten, dünkt mir jetzt schrecklich, fürchterlich!“ (S. 75, Z. 2162-2165) Sie will mit ihrer Amme ins Schloss fliehen, doch Paulet befiehlt ihr, sie müsse die Königin im Park erwarten.

Dritter Auftritt

Als Maria Stuart den Grafen Shrewsbury kommen sieht, fleht sie, er solle ihr den verhassten Anblick Elisabeths ersparen. Er ermutigt sie, die Chance zu ergreifen, ihren Hass gegen die Königin zu vergessen und ehrerbietig zu sein. Maria aber vermutet, dass das Treffen für sie zum Fluch werden wird und eine Versöhnung unmöglich ist. Talbot berichtet ihr daher, wie ergriffen Königin Elisabeth von ihrem Brief war. Außerdem verrät er Maria Stuart, dass sie Graf Leicester das Treffen mit Elisabeth zu verdanken hat.

Vierter Auftritt

Königin Elisabeth, Graf Leicester und Gefolge tauchen auf. Ihr Gefolge lässt die Königin von Talbot zurück nach London schicken. Während sie Maria mustert, spricht sie zu Paulet, schwärmt, dass ihr Volk sie verehrt wie einen Gott. Maria, die verzweifelt an ihrer Amme lehnt, klagt: „O Gott, aus diesen Zügen spricht kein Herz!“ (S. 77, Z. 2232) Elisabeth stellt sich daraufhin dumm und fragt, wer die Lady sei. Leicester spielt mit und erklärt der scheinbar Nichtsahnenden, dass der Himmel sie zu Maria Stuart gelenkt hätte und sie Mitleid siegen lassen solle. Auch Shrewsbury appelliert an Elisabeth, ihr Auge auf die unglückliche Maria zu richten. Die Königin aber sieht in Maria Stuart eine stolze Frau. Maria Stuart fällt daraufhin vor Elisabeth nieder und erbittet ihre Gnade. Elisabeth geht nicht darauf ein, sondern antwortet kalt, sie sei dem Trieb der Großmut gefolgt mit Maria zu sprechen. Die Stuart nimmt allen Mut zusammen und erklärt, sie würde alles vergessen, was Elisabeth ihr angetan hat, sie solle ihr nur die Schuld ebenfalls erlassen. Königin Elisabeth geht nicht darauf ein. Sie wirft Maria Stuart Eifersucht und Gier auf die englische Krone vor. Diese erklärt daher, Elisabeth habe gesiegt, sie würde auf die Krone verzichten. Die schottische Königin hofft so, endlich freigelassen zu werden - doch sie hat sich offenbar getäuscht. Indem Elisabeth sie beleidigt, verliert Maria ihre Demut, verteidigt sich und greift Elisabeth scharf an. Shrewsbury und Leicester versuchen, den Streit zu schlichten. Doch Elisabeth verlässt zornig den Park.

Fünfter Auftritt

Maria und ihre Amme bleiben alleine zurück. Diese ist fassungslos über das Verhalten der Stuart und sieht keinerlei Hoffnung mehr. Maria Stuart selbst fühlt sich dennoch erleichtert, weil sie endlich einen Moment des Triumphs über Elisabeth erleben durfte. Und das auch noch vor den Augen von Leicester.

Sechster Auftritt

Mortimer kommt zu den beiden Frauen hinzu und schickt die Amme weg. Er ist begeistert von Maria Stuarts Mut, schwärmt leidenschaftlich von ihr. Die schottische Königin jedoch will eigentlich nur endlich wissen, was Leicester zu ihrem Schreiben sagte. Daraufhin erklärt Mortimer ihr, der Graf sei ein Feigling und nur er könne sie retten. Er berichtet ihr mit irren Blicken von seinem Plan, nachts das Schloss zu stürmen, die Wächter zu ermorden und sie zu befreien. Maria Stuart ist schockiert und sieht sich dem nächsten „Schrecknis“ gegenüber. Mortimer bedrängt sie weiter, presst sie an sich und fordert ihre Liebe als Dank. Plötzlich kommt Hanna herbeigeeilt und warnt sie vor bewaffnetem Volk, das in den Garten eindringt. Während Mortimer sich mit dem Degen bewaffnet, rennen die beiden Frauen Richtung Haus.

Siebenter Auftritt

Paulet und Drury stürzen herbei. Paulet befiehlt, das Schloss zu sichern und Maria Stuart ins Gefängnis zu werfen. Auf Mortimers drängende Fragen hin, verkündet er: Die Königin von England wurde auf Londons Straßen ermordet.

Achter Auftritt

Nachdem Paulet und Drury ins Haus eilten, bleibt Mortimer irritiert zurück. Er kann die Nachricht von Elisabeths Tod nicht glauben. Dann reißt sein Freund Okelly ihn aus seinen Gedanken. Dieser fleht ihn an, sofort zu fliehen. Der Mordanschlag auf Elisabeth ist missglückt. Okelly ist sich sicher, Mortimer und seine Freunde sind dem Tode geweiht. Mortimer aber will nicht fliehen.