Der fünfte und letzte Aufzug des Trauerspiels handelt zunächst im Schloss zu Fotheringhay, später dann im Palast zu Westminster.

Erster Auftritt

Hanna Kennedy verpackt am Morgen des Hinrichtungstages weinend die Reichtümer von Maria Stuart, die ihr von Paulet und Drury wieder gebracht wurden. Plötzlich tritt Melvil, Marias ehemaliger Haushofmeister, ein, um sich von seiner Königin zu verabschieden. Hanna berichtet ihm, wie Maria Stuart noch in der Nacht auf ihre Befreiung hoffte, als sie ein Pochen hörte. Das Pochen rührte aber nicht von den Befreiern, sondern vom Aufbau des Schafotts. Daraufhin schrieb die Königin laut Kennedy gefasst ihr Testament, betete und weinte, weil ihr Todesurteil so viele Menschen in Kummer stürzte.

Zweiter Auftritt

Margareta Kurl, Marias Kammerfrau, kommt herbei, um die Amme zu Maria Stuart zu schicken. Gegenüber Melvil beschuldigt sie ihren Mann, Marias ehemaligen Schreiber, der Falschaussage. Nur durch seinen Verrat, wurde die schottische Königin verurteilt. Er aber soll wieder aus dem Tower freikommen, sobald Maria Stuart hingerichtet wurde.

Dritter Auftritt

Burgoyn tritt in das Zimmer, um für Maria Stuart ein Glas Wein zu ordern. Den soll sie vor ihrer Hinrichtung trinken, damit er ihr Kraft gibt, wenn ihre Stärke doch der Todesfurcht weicht. Dann kündigt Kennedy an, dass Maria Stuart gleich zu ihnen stoßen wird.

Vierter Auftritt

Weitere Kammerfrauen kommen hinzu, brechen beim Wiedersehen mit Melvil in Tränen aus und berichten, dass Maria Stuart ein letztes Mal allein sein will.

Fünfter Auftritt

Margareta Kurl kommt bleich und zitternd mit dem Becher Wein zurück. Sie warnt die anderen, dass der Hinrichtungssaal voller Menschen ist.

Sechster Auftritt

Maria Stuart tritt in Weiß gekleidet, mit Diadem, schwarzem Schleier, Rosenkranz und einem Kreuz in der Hand ins Zimmer. Sie fordert ihre Bediensteten auf, nicht zu weinen, sondern sich mit ihr zu freuen, dass ihr Leid nun ein Ende hat. Sie verteilt ihr Hab und Gut an die Anwesenden, schickt sie in die Obhut des französischen Königs und verabschiedet sich.

Siebenter Auftritt

Maria und Melvil bleiben allein zurück. Als sie klagt, weil ihr eine letzte Beichte verwehrt bleibt, offenbart Melvil ihr, dass er inzwischen Priester ist. Sie sinkt vor ihm nieder und beichtet ihren Hass auf Elisabeth, die sündige Liebe zu Leicester und trotz allerleih bereits geleisteter Sühne nocheinmal den Mord an ihrem Gatten. Als Melvil sie auf die Anschläge auf Elisabeth anspricht, beteuert sie ihre Unschuld: „Ich habe alle Fürsten aufgeboten, aus unwürd‘gen Banden mich zu befrein, doch nie hab ich durch Vorsatz oder Tat das Leben meiner Feindin angetastet!“ (S. 132, Z. 3727-3730) Nach dieser Beichte ist Maria Stuart bereit zu sterben.

Achter Auftritt

Gemeinsam mit Leicester und Paulet tritt Burleigh zu den beiden ins Zimmer. Er erfrägt in Elisabeths Auftrag die letzten Wünsche von Maria Stuart. Diese bittet darum, dass ihr Testament vollzogen wird und dass ihr Diener ihr Herz nach Frankreich bringen darf. Dann bittet sie bei Burleigh um Verzeihung für ihre Entgleisung gegenüber Elisabeth und lässt ihr ausrichten, dass sie ihr die Hinrichtung vergebe. Daraufhin gibt Paulet ihr versöhnlich die Hand.

Neunter Auftritt

Hanna Kennedy und die anderen Kammerfrauen dringen mit entsetzten Gesichtern ins Zimmer. Hinter ihnen ist der Sheriff zu sehen, der Maria Stuart zum Schafott führen soll. Diese zeigt sich tapfer und bittet Melvil und Hanna, sie auf ihrem letzten Gang zu begleiten. Burleigh will ihr diesen Wunsch zunächst nicht gestatten, bis Paulet ihn dazu ermutigt. Gerade als Maria Stuart gehen will, erblickt sie Leicester, droht zusammenzubrechen und wird ausgerechnet von ihm aufgefangen. Mit sanfter Stimme spricht sie ihn auf sein eigentliches Versprechen an und wünscht ihm Glück mit Elisabeth, die er ihr vorgezogen hat. Dann verlässt sie mit Melvil, der Amme, dem Sheriff, Burleigh und Paulet den Raum.

Zehnter Auftritt

Leicester bleibt alleine zurück und wird von Schuldgefühlen geplagt. Marias Anblick hat trotz aller Bemühungen, standhaft zu bleiben, sein Herz gerührt. Und so sehr er versucht, sich Mut zuzusprechen und der Hinrichtung zuzusehen; er kann es nicht. Fliehen kann er allerdings ebenso wenig, denn die Tür ist verschlossen. So muss er mitanhören, wie Maria im Raum unter ihm hingerichtet wird. Als ihr Kopf fällt, sinkt er ohnmächtig zusammen.

Elfter Auftritt

Königin Elisabeth tritt voller Unruhe durch eine Seitentüre im Palast zu Westminster in ihr Zimmer. Sie erwartet sehnsüchtig und zugleich mit Schrecken die Nachricht über Maria Stuarts Hinrichtung.

Zwölfter Auftritt

Ein Page tritt an die Königin heran und berichtet ihr, dass Leicester und Burleigh nicht in London sind. Ihr wird daraufhin klar, dass Maria Stuart tot sein muss. Zunächst fühlt sie sich erleichtert, dann wiederum zittert sie vor Angst und will die Gefallene beweinen. Den Pagen schickt sie unterdessen davon, Davison zu holen.

Dreizehnter Auftritt

Graf Shrewsbury betritt den Raum und überbringt ihr schlechte Neuigkeiten: Kurl, der Schreiber von Maria Stuart, hat ihm wenige Minuten zuvor im Tower von London gestanden, dass seine Aussage falsch und die Papiere gefälscht waren. Außerdem habe Kurl dies hinunter in die Gassen Londons gebrüllt und für Aufsehen beim Volk gesorgt. Shrewsbury fordert daher eine neue Untersuchung des Falls. Elisabeth verschweigt ihm, dass es sowieso zu spät ist und tut so, als würde sie auf seinen Wunsch eingehen.

Vierzehnter Auftritt

Als Davison in den Raum tritt, bittet sie ihn um das Urteil, das sie ihm angeblich zur Verwahrung gegeben hatte. Dieser erklärt verzweifelt, dass das Urteil längst wie befohlen in Burleighs Händen liege. Daraufhin lässt Elisabeth ihn wegen Missbrauchs ihres Namens in den Tower sperren.

Letzter Auftritt

Burleigh kommt hinzu, verbeugt sich vor der Königin und verkündet Maria Stuarts Tod. Shrewsbury verhüllt sein Gesicht, Davison zeigt sich noch verzweifelter. Elisabeth fragt Burleigh demonstrativ, ob er von ihr den tödlichen Befehl erhalten habe. Als dieser verneint, beschuldigt sie ihn, ihrer Milde vorausgegriffen zu haben und schickt ihn fort. Shrewsbury, den sie zu ihrem Führer machen will, lehnt dies daraufhin ab. Er hat erkannt, dass er ihren edlen Charakter nicht retten konnte und verlässt sie. Doch das ist nicht die einzige Enttäuschung für Elisabeth. Als sie Kent bittet, Leicester herbeizuholen, muss sie erfahren, dass dieser nach Frankreich geflohen ist. Mit ruhiger Fassung bleibt Elisabeth alleine zurück.