Der zweite Aufzug spielt im Palast zu Westminster.

Erster Auftritt

Der Graf von Kent und Sir William Davison, beide Staatssekretäre, begegnen sich und sprechen über die Brautwerbung des französischen Königs um Elisabeth. Diese hält sich ihre Entscheidung trotz Eingeständnissen des französischen Königs weiterhin offen.

Zweiter Auftritt

Die Königin wird von Graf Leicester zu den beiden Männern geführt. Des Weiteren treten der Graf Aubespine, Bellievre, Graf Shrewsbury, Lord Burleigh und andere französische und englische Herren dazu. Elisabeth macht vor allen Männern deutlich, dass sie jetzt noch keine Hochzeitszusage geben möchte. Ihre Freiheit sei ihr zu wertvoll. Würde das Volk nicht auf eine Heirat pochen, würde sie gerne als Jungfrau sterben.

Dritter Auftritt

Nachdem sich die anderen Herren entfernt haben, sprechen Wilhelm Cecil (Burleigh), Robert Dudley (Leicester) und George Talbot (Shrewsbury) mit der Königin über das Todesurteil von Maria Stuart. Burleigh erklärt, dass er die Stuart als Gefahr sehe, weil sie zu viele heimliche Anhänger im Volk habe. Elisabeth aber wünscht ein milderes Urteil und auch Talbot hält eine Hinrichtung für falsch. Als Elisabeth in Richtung des Todesurteils tendiert, fragt Leicester, warum sie sich überhaupt vor einer gescheiterten Königin fürchte. Gerade jetzt, wo sogar Frankreich Maria Stuart den Rücken zukehre.

Vierter Auftritt

Ritter Paulet kommt zu der Runde hinzu, um der Königin seinen Neffen Mortimer vorzustellen. Dieser erklärt Elisabeth, er habe sich von den schottischen Verbannten das Vertrauen erstohlen und deren neueste Pläne ausspioniert, wonach diese ihre Hoffnung auf Spaniens Hilfe richteten. Nach diesem Gespräch übergibt Paulet der Königin Maria Stuarts Brief. Während diese das Schreiben liest, sprechen Mortimer und Leicester heimlich miteinander. Burleigh rätselt unterdessen, was in dem Brief stehen könnte. Als er von dem gewünschten Treffen erfährt, wehrt er vehement ab. Die Königin aber ist zunächst gerührt von dem Schreiben und wird von Leicester und Talbot darin bestätigt. Anstatt eine Entscheidung zu treffen, schickt Elisabeth die Lords weg und bittet nur Mortimer, noch zu bleiben.

Fünfter Auftritt

Elisabeth lobt Mortimer für seinen Einsatz, woraufhin dieser ihr all seine Dienste verspricht. Die Königin erklärt ihm daraufhin, dass die Krone auf ihrem Kopf wegen Maria Stuart wankt, dass sie ihre Hand aber offiziell frei von Blut lassen wollte. Sie bittet ihn, Maria heimlich zu ermorden. Mortimer geht auf ihre Bitte ein.

Sechster Auftritt

Mortimer bleibt alleine zurück und spricht mit sich selbst: „Geh, falsche, gleisnerische Königin! Wie du die Welt, so täusch ich dich.“ (S. 57, Z. 1632-1633) Er freut sich, dass er nun mehr Zeit gewonnen hat, um Maria Stuart zu retten. Dann erinnert er sich daran, dass er dem Lord Marias Brief übergeben muss. Eine Auftrag, den er nur ungern ausübt, da er Leicester nicht mag.

Siebenter Auftritt

Paulet tritt an Mortimer heran, um sich nach dem Gespräch mit der Königin zu erkundigen. Mortimer schweigt über die Bitte von Elisabeth. Paulet aber ahnt etwas und rät seinem Neffen, sein Gewissen nicht zu verletzen. Er droht ihm sogar, ihn zu verfluchen, falls er der Königin den Mord zugesagt haben sollte. Doch dann kommt Leicester herbei. Als er schwärmt, wie sehr sich die Königin auf Mortimer verlassen würde, geht Paulet wütend ab.

Achter Auftritt

Leicester reagiert verwundert über Paulets Verhalten und zweifelt nach Mortimers ausweichender Antwort auch an dessen Vertrauenswürdigkeit. Dieser aber übergibt ihm den Brief von Maria Stuart. Leicester küsst Marias Bild und liest das Schreiben entzückt durch. Er gesteht Mortimer, dass er es bereue, Maria Stuart vor Jahren nicht geheiratet zu haben, in der Hoffnung, Elisabeths Herz zu erobern. Nachdem diese ihn nun fallen ließ, habe er erkannt, was er an Maria aufgegeben hatte. Er habe nur keinen Weg gefunden, sie zu befreien. Als Mortimer von seinem Plan berichtet, wehrt Leicester aber ab. Die beiden streiten über die Befreiung und kommen zu keinem Ergebnis.

Neunter Auftritt

Königin Elisabeth kommt auf Leicester zu. Dieser versucht, mit Komplimenten von seiner betretenen Verfassung abzulenken und klagt, weil er sie nun verlieren müsse. Elisabeth erwidert daraufhin, dass ihr Herz anders entschieden hätte, könne sie so frei wählen wie Maria Stuart es tat. Sie spricht eifersüchtig über Maria Stuart, die sich nicht den Königspflichten unterwarf und alle Männer mit ihrer Schönheit verzückte. Daraufhin versucht Leicester die Königin zu einem Treffen mit Maria Stuart zu bewegen. Angeblich damit sie selbst sehen kann, dass sie die Schönere ist und Maria Stuart damit peinigt. Weil sie ihn schon genug verletzt hat, willigt Elisabeth spontan ein, Maria Stuart noch am selben Tag im Park zu treffen.