Aufgabe 2 – Gentechnik, Glyphosat

Glyphosat ist eines der weltweit am häufigsten verwendeten und am meisten umstrittenen Herbizide in der Landwirtschaft. Es wird eingesetzt, um das Wachstum unerwünschter Pflanzen zu unterbinden. Nur gentechnisch veränderte Nutzpflanzen sind gegen dieses Herbizid unempfindlich. Glyphosat hemmt in der Pflanzenzelle das Enzym EPSP-Synthase. Dieses Enzym katalysiert die Reaktion von Shikimat-3-phosphat zu 5-Enolpyruvyl-shikimat-3-phosphat (EPSP). Dies ist ein spezifisch in Pflanzenzellen ablaufender Reaktionsschritt im Biosyntheseweg der Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan (Abbildung 1).

Abb. 1: Biosyntheseweg

1.1

Erkläre, weshalb Pflanzen nach Behandlung mit Glyphosat absterben.

2 VP

Pflanzen mit und Pflanzen ohne Glyphosat-Behandlung wurden auf ihren Gehalt an Shikimat-3-phosphat untersucht (Abbildung 2).

1.2

Erstelle beschriftete Skizzen, welche

die durch EPSP-Synthase katalysierte Reaktion veranschaulichen sowie

einen möglichen Mechanismus der Hemmung von EPSP-Synthase durch Glyphosat aufzeigen.

3 VP

1.3

Ordne die Pflanzen mit und die Pflanzen ohne Glyphosat-Behandlung den Ergebnissen in Abbildung 2 begründet zu.

2 VP

Abb. 2: Gehalt an Shikimat-3-phosphat

Seit Kurzem beobachtet man, dass bei intensivem Glyphosat-Einsatz zunehmend Pflanzen auftreten, die gegen dieses Herbizid unempfindlich sind. Bei der näheren Untersuchung dieses Phänomens wurden zwei Hypothesen überprüft. Hypothese 1 besagt, dass Pflanzen eine veränderte EPSP-Synthase bilden, die gegenüber Glyphosat unempfindlich ist.

2.1

Erkläre, welche Veränderung des EPSP-Synthase-Moleküls nach dieser Hypothese eine Unempfindlichkeit gegen Glyphosat bewirken könnte.

2 VP

In der Basensequenz des EPSP-Synthase-Gens Glyphosat-empfindlicher und Glyphosat-unempfindlicher Pflanzen zeigen sich nur die in Abbildung 3 dargestellten Unterschiede.

Abb. 3: Ausschnitte des codogenen Strangs des EPSP-Synthase-Gens

2.2

Ermittle mithilfe der Codesonne (siehe Anlage) die zugehörigen Aminosäuresequenzen und prüfe die Gültigkeit von Hypothese 1.

3 VP

Hypothese 2 besagt, dass Pflanzen über eine „normale" EPSP-Synthase verfügen, die gegenüber Glyphosat empfindlich ist. Dieses Enzym liegt in stark erhöhter Konzentration in den Zellen vor.

3.1

Erkläre, weshalb Pflanzen gegen Glyphosat unempfindlich werden können, wenn die Konzentration der „normalen" EPSP-Synthase in ihren Zellen stark erhöht ist.

2 VP

3.2

Erläutere zwei Möglichkeiten, wie es infolge einer Mutation zu einer Erhöhung der Konzentration des Enzyms EPSP-Synthase in den Zellen kommen könnte.

3 VP

Zur Überprüfung von Hypothese 2 wurde die EPSP-Synthase-Aktivität in Pflanzenzellen unter dem Einfluss von Glyphosat bestimmt. In Abbildung 4 sind die Ergebnisse dieser Untersuchungen für Glyphosat-empfindliche und Glyphosat-unempfindliche Pflanzen dargestellt.

Abb. 4: EPSP-Synthase-Aktivität in Abhängigkeit von der intrazellulären Glyphosat-Konzentration bei Glyphosat-empfindlichen und Glyphosat-unempfindlichen Pflanzen

Erläutere die in Abbildung 4 dargestellten Kurvenverläufe und prüfe, ob die Untersuchungsergebnisse die Hypothese 2 bestätigen.

3 VP

20 VP

1.1

Erklärung des Absterbens nach Behandlung mit Glyphosat:
Durch die EPSP-Synthase wird die Bildung von EPSP aus Shikimat-3-phosphat katalysiert. Bei der Behandlung mit Glyphosat wird das Enzym EPSP-Synthase gehemmt und es kann kein EPSP mehr gebildet werden, welches aber eine notwendige Vorstufe im Syntheseweg verschiedener Aminosäuren bei Pflanzen ist. Folglich kommt es bei behandelten Pflanzen zu einem Phenylalanin-, Tyrosin- und Tryptophan-Mangel. Dadurch wird die Proteinbiosynthese gestört und lebenswichtige Proteine (z.B. Enzyme, Transport- und Membranproteine) können nicht mehr gebildet werden, wodurch die Pflanze abstirbt.

1.2

Erstellung beschrifteter Skizzen:

a) EPSP-Synthase-Reaktion:

Diagramm der EPSP-Synthase mit Shikimat-3-phosphat als Substrat und EPSP als Produkt.

b) EPSP-Hemmung:

Illustration zur kompetitiven und allosterischen Hemmung von Enzymen mit Glyphosat und Shikimat-3-phosphat.

Diagramm zur irreversiblen Hemmung von EPSP-Synthase durch Glyphosat und Shikimat-3-phosphat.

1.3

Zuordnung der Pflanzen:

Die Pflanzengruppe A stellt mit Glyphosat behandelte Pflanzen dar. Die sehr hohe Konzentration des Shikimat-3-phosphats (ca. 26 $\mu g / mL$ ) führt auf einen Substratstau zurück: Die Glyphosat-Hemmung der EPSP-Synthase bewirkt, dass Shikimat-3-phosphat nicht zu EPSP umgesetzt werden kann und sich anstaut.
Die Pflanzengruppe B zeigt unbehandelte Pflanzen. Der geringe Gehalt an Shikimat-3-phosphat (ca. 2 $\mu g / mL$ ) zeigt, dass die EPSP-Synthase nicht blockiert wurde. Das Shikimat-3-phosphat kann in EPSP umgewandelt werden und reichert sich nicht an.

2.1

Erklärung der Glyphosat-Unempfindlichkeit gemäß Hypothese 1:
Aufgrund der Veränderung des EPSP-Synthase-Moleküls an der Bindestelle für Glyphosat, die durch eine Mutation des entsprechenden Gens bewirkt wird, kann sich kein Glyphosat mehr an das aktive oder allosterische Zentrum der EPSP-Synthase anlagern. Das Enzym kann somit nicht mehr gehemmt werden, aber das Substrat (Shikimat-3-phosphat) kann weiterhin am aktiven Zentrum binden.

2.2

Ermittlung der Aminosäuresequenz und Überprüfung von Hypothese 1:

Glyphosat-empfindliche Pflanzen:

DNA- und mRNA-Sequenzen sowie die zugehörige Aminosäuresequenz in einer Übersicht dargestellt.

Glyphosat-unempfindliche Pflanzen:

DNA- und mRNA-Sequenzen sowie Aminosäuresequenz in einer Übersicht dargestellt.

Trotz veränderter DNA-Sequenz ergibt sich im Protein eine identische AS-Sequenz (stumme Mutationen). Damit kann Hypothese 1 nicht gültig sein.

3.1

Erklärung der Glyphosat-Unempfindlichkeit gemäß Hypothese 2
Wenn die EPSP-Synthase-Konzentration in der Zelle stark erhöht ist, können nicht mehr alle EPSP-Synthase-Moleküle gebunden und deaktiviert werden, da die Glyphosat-Moleküle (bei Verabreichung in gebräuchlicher Dosis) nicht ausreichen. Dadurch wird weiterhin EPSP gebildet, die genannten Aminosäuren bereitgestellt und die Proteinbiosynthese ermöglicht.

3.2

Erläuterung von Mutationen, die zu einer erhöhten EPSP-Synthase-Konzentration führen könnten (zwei erforderlich):

Durch eine Mutation in der Promotorsequenz des EPSP-Synthase-Gens könnte eine Erhöhung der Affinität der RNA-Polymerase zum Promotor bewirkt werden. Daraus würden eine erhöhte Transkriptionsrate und eine höhere Enzymkonzentration folgen.
Durch eine Mutation im Gen eines aktivierenden Transkriptionsfaktors könnte die Affinität dieses Aktivatorproteins zu seiner DNA-Bindestelle (Promotor oder Enhancer) gesteigert werden und damit eine erhöhte Transkriptionsrate bewirken.
Durch eine Mutation im Gen eines hemmenden Transkriptionsfaktor könnte die Affinität dieses Repressorproteins zu seiner DNA-Bindestelle (Silencer) vermindert werden und damit die Transkriptionsrate erhöhen.
Durch Mutationen in den regulatorischen DNA-Sequenzen (Enhancer und Silencer) kann die Bindungsaffinität regulatorischer Proteine beeinflusst werden, wodurch die Transkriptionsrate und damit die Enzymkonzentration erhöht wird.

Weitere mögliche Ursache:
Durch Polyploidisierung oder eine Genduplikation des EPSP-Synthase-Gens könnte die Genprodukt-Konzentration erhöht werden, die zu einer erhöhten EPSP-Synthase-Konzentration in den Zellen führen.

Erläuterung der Kurvenverläufe:

In dem Diagramm wird die Abhängigkeit der EPSP-Synthase-Aktivität (y-Achse) in relativen Einheiten von der intrazellulären Glyphosat-Konzentration (x-Achse) in relativen Einheiten für Glyphosat-empfindliche und Glyphosat-unempfindliche Pflanzen dargestellt.

Kurve 1: Die Glyphosat-empfindlichen Pflanzen haben ohne Glyphosat-Einfluss eine niedrige maximale Enzymaktivität von 0,4 rel. Einheiten. Wenn die Glyphosat-Konzentration zunimmt, fällt die Enzymaktivität stark ab. Es ist zu sehen, dass ab ca. 5 rel. Einheiten fast keine Enzymaktivität mehr messbar ist, da die Glyphosat-Moleküle fast alle Enzymmoleküle hemmen.
Kurve 2: Die Glyphosat-unempfindlichen Pflanzen zeigen ohne den Einfluss von Glyphosat eine maximale Enzymaktivität von 1,8 rel. Einheiten. Das entspricht einer 4,5-Fach höheren Enzymaktivität als bei Glyphosat-empfindlichen Pflanzen. Nimmt die Glyphosat-Konzentration zu, sinkt die Enzymaktivität bis zu 4 rel. Einheiten nahezu linear und danach exponentiell ab. Die Enzymaktivität lässt sich bei 30 rel. Einheiten kaum noch nachweisen. Der Kurvenverlauf zeigt, dass die Konzentration des Enzyms EPSP-Synthase hoch ist und die Aktivität nur gehemmt werden kann, wenn die entsprechende Glyphosat-Konzentration höher ist.

Überprüfung der Gültigkeit von Hypothese 2:
Die Versuchsergebnisse bestätigen Hypothese 2, da Glyphosat-unempfindliche Pflanzen eine "normale" EPSP-Synthase haben und Glyphosat deren Aktivität hemmen kann. Außerdem liegt das Enzym in stark erhöhter Konzentration in den Zellen vor, was zum einen durch die 4,5-fach höhere Enzymaktivität gegenüber Glyphosat-empfindlichen Pflanzen gezeigt wird und zum anderen durch die Notwendigkeit einer wesentlich höheren Glyphosat-Konzentration, damit alle Enzyme gehemmt werden.