Bestimmte moderne Waschmittel enthalten Peptidasen, die durch Hydrolyse von Proteinen dafür sorgen, dass wasserlösliche Produkte entstehen. So lassen sich proteinhaltige Verschmutzungen leichter aus Kleidungsstücken auswaschen. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse einer Versuchsreihe zur Aktivität einer Peptidase aus dem Bakterium Streptomyces thermovulgaris. Beschreibe die in Abbildung 1 dargestellten Versuchsergebnisse und leite daraus eine Empfehlung für die Anwendung von Waschmitteln ab, die diese Peptidase enthalten.

In einer Versuchsreihe wird die pH-Abhängigkeit der Peptidase Trypsin untersucht. In jeweils einem Reagenzglas lässt man eine Lösung des Proteingemischs Gelatine erstarren. Auf diese Schicht wird zunächst Sand und anschließend eine Flüssigkeit aufgetragen (Abb. 2, Tab. 1). Tabelle 1 zeigt Informationen zu den durchgeführten fünf Versuchsansätzen.

Tab. 1: Versuchsansätze zur Bestimmung der Trypsin-Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert; die verwendete Trypsin-Lösung hat bei allen Ansätzen die gleiche Trypsin-Konzentration

Erkläre die Versuchsergebnisse mithilfe einer Modellvorstellung zur Funktionsweise von Enzymen. Gehe auch auf die Bedeutung des Versuchsansatzes 1 ein.

Die Enzyme Trypsin und Chymotrypsin katalysieren im menschlichen Darm die Hydrolyse von Proteinen. Die beiden Enzyme reagieren substratspezifisch: Trypsin katalysiert die Hydrolyse von Peptidbindungen nach Aminosäure-Bausteinen mit einer Aminogruppe im Rest, Chymotrypsin die Hydrolyse von Peptidbindungen nach Aminosäure-Bausteinen mit hydrophoben Resten. Tabelle 2 gibt Informationen zu den Aminosäuren Lysin und Phenylalanin.

Tab. 2: Strukturformeln und isoelektrische Punkte von Lysin und Phenylalanin

Formuliere die Strukturformelgleichung der Hydrolyse des Dipeptid-Moleküls Lys-Phe.
Leite mithilfe der Tabelle 2 die jeweils überwiegend vorliegende Form der beiden Aminosäure-Moleküle im Dünndarm bei ab.

Für die spezifische katalytische Aktivität der Enzyme Trypsin und Chymotrypsin ist eine in der Nähe des aktiven Zentrums gelegene „Tasche“ verantwortlich. Die unterschiedlichen Reste der Aminosäure-Bausteine der „Taschen“ beider Enzym-Moleküle bilden unterscheidliche Wechselwirkungen zu den Resten der Lysin- und Phenylalanin-Bausteine der jeweiligen Substrat-Moleküle aus.
Stelle jeweils eine Hypothese zum Bau der Reste in den „Taschen“ der Trypsin- und Chymotrypsin-Moleküle auf, welche die Spezifität der Enzyme erklärt.

Am Zentrum für Meeres- und Klimaforschung der Universität Hamburg wird über standardisierte Messungen der Aktivität der Peptidase Trypsin der Ernährungszustand von Fischlarven bestimmt, da es einen Zusammenhang zwischen aufgenommener Nahrung und der Menge an gebildetem Trypsin gibt.

Für die Messung werden die Larven in einer Puffer-Lösung homogenisiert. Der Puffer wird hergestellt, indem Ammoniak-Lösung der Konzentration mit Salzsäure der Konzentration versetzt werden. Berechne den pH-Wert der eingesetzten Puffer-Lösung.

Um die Menge des von den Larven hergestellten Trypsins zu bestimmen, wird folgendes Experiment durchgeführt: Das gewonnene Trypsin wird mit einem Substrat versetzt und die Trypsin-Aktivität ermittelt. Zur Bestimmung der Trypsin-Aktivität wird die Stoffmenge des hydrolysierten Substrats (hS) nach bestimmten Zeiträumen ermittelt (Tab. 3):

Tab. 3: Stoffmenge des hydrolysierten Substrats nach bestimmten Zeiträumen

nach: Ueberschär, B. (1999). Die Trypsinaktivität als biochemische Indikator zur Bestimmung des Ernährungszustandes sowie der Freßaktivität von Fischlarven und seine Anwendung in Feldstudien (Doctoral dissertation, Universităt Hamburg).

Zeichne mit den Werten aus Tabelle 3 ein Diagramm und ermittle die mittlere Reaktionsgeschwindigkeit im Zeitraum von bis

Wissenschaftler versuchen pflanzliche Proteinquellen, etwa Soja, in der Fischzucht einzusetzen. Dabei stellten sie fest, dass in der Sojabohne kleine Proteine vorkommen, die unter der Bezeichnung Bowman-Birk-Inhibitoren bekannt geworden sind. Forschende haben die Hypothese aufgestellt, dass diese Proteine als kompetitive Hemmstoffe des Trypsins wirken.
Skizziere ein Diagramm, das den vermuteten Einfluss der Bowman-Birk-Inhibitoren auf die Trypsin-Aktivität in Abhängigkeit von der Substratkonzentration zeigt. Beschreibe eine experimentelle Vorgehensweise zur Überprüfung der Hypothese.

Beschreibung der Versuchsergebnisse und Ableitung einer Anwendungsempfehlung Die in der Abbildung dargestellten Ergebnisse zeigen signifikante Unterschiede in der Enzymaktivität bei verschiedenen Temperaturen. Bei und bleibt die Enzymaktivität konstant hoch, was darauf hindeutet, dass die Peptidase unter milden Temperaturen stabil und effektiv arbeitet. Diese Temperaturbereiche sind ideal für die meisten Waschprozesse, da sie eine ausreichende Reinigungswirkung bieten, ohne zusätzliche Energie für das Heizen des Wassers zu benötigen. Bei höheren Temperaturen, insbesondere bei und darüber, zeigt die Peptidase einen deutlichen und schnellen Abfall in der Aktivität schon innerhalb der ersten 20 Minuten. Dies weist auf eine thermische Denaturierung des Enzyms hin, bei der die Proteinstruktur der Peptidase beschädigt wird, was zu einem Verlust der enzymatischen Funktion führt. Für Waschmittel, die in heißem Wasser verwendet werden, wäre diese Peptidase daher weniger geeignet. Auf Grundlage dieser Versuchsergebnisse wird empfohlen, Waschmittel, die diese spezielle Peptidase enthalten, vor allem für Kaltwäsche und Waschprogramme mit moderaten Temperaturen zu formulieren.

Erklärung der Ergebnisse aus Trypsin-Aktivitätsversuchen Trypsin, ein proteolytisches Enzym, das spezifisch die C-terminale Seite bestimmter Aminosäuren wie Lysin und Arginin in Peptidketten spaltet, zeigt eine ausgeprägte pH-Abhängigkeit in seiner Aktivität. Diese Abhängigkeit ist eng mit der Struktur des Enzyms und der Ionisierung seiner aktiven Stelle verbunden. Bei einem neutralen pH-Wert von zeigt Trypsin minimale Aktivität, was durch das Verbleiben des Sandes auf der Oberfläche der Gelatine deutlich wird. Dies lässt darauf schließen, dass die ionischen Zustände der funktionellen Gruppen im aktiven Zentrum des Trypsins bei diesem pH-Wert nicht optimal für die Substratbindung und -spaltung sind. Im leicht alkalischen Bereich, insbesondere bei erreicht Trypsin seine maximale Aktivität, was durch das tiefe Eindringen des Sandes in die Gelatine illustriert wird. Bei diesem pH-Wert sind die Histidinreste im aktiven Zentrum des Trypsins ideal ionisiert, was eine effiziente Bindung und Hydrolyse der Peptidbindungen ermöglicht. Die Konformation des aktiven Zentrums ist optimal auf das Substrat abgestimmt, was die katalytische Effizienz maximiert. Bei einem höheren pH-Wert von nimmt die Aktivität des Trypsins wieder ab. Obwohl das Enzym weiterhin aktiv ist, führen Veränderungen in der Ionisierung und Konformation des aktiven Zentrums dazu, dass die Effizienz der Substratbindung und -spaltung reduziert wird. Dies zeigt, dass die strukturelle Integrität und Ladungsverteilung des aktiven Zentrums entscheidend für die enzymatische Aktivität sind und durch den pH-Wert beeinflusst werden können.

Strukturformelgleichung für die Hydrolyse des Dipeptids Lys-Phe Vorliegende Form im Dünndarm Bei liegen Lysin und Phenylalanin jeweils in zwitterionischen Formen vor, wobei sich ihre Ladungszustände aufgrund ihrer unterschiedlichen isoelektrischen Punkte unterscheiden. Lysin, dessen isoelektrischer Punkt bei liegt, zeigt eine positive Nettoladung, da der pH-Wert von unter diesem Punkt liegt. Bei diesem pH-Wert ist die primäre Aminogruppe an der Seitenkette des Lysins protoniert während die Carboxylgruppe deprotoniert ist Dies macht Lysin insgesamt positiv geladen. Phenylalanin hingegen, mit einem isoelektrischen Punkt von ist bei neutral, da sein pH-Wert weit über dem isoelektrischen Punkt liegt. Hierbei ist die Carboxylgruppe deprotoniert und die Aminogruppe protoniert was zu einer zwitterionischen, aber insgesamt neutralen Form führt.

Hypothesen zur Struktur und Spezifität der aktiven Taschen von Trypsin und Chymotrypsin

Berechnung des pH-Werts der Pufferlösung Zur Berechnung des pH-Werts der Pufferlösung, die durch Mischen von Ammoniaklösung mit Salzsäure hergestellt wird, wird die Henderson-Hasselbalch-Gleichung verwendet: Die Reaktion von Ammoniak mit Salzsäure führt zur Bildung von Ammoniumionen Ursprünglich wurde die Pufferlösung mit einer Ammoniaklösung und einer Salzsäure hergestellt. Nach der Reaktion bleiben unverbraucht, während aus der neutralisierten -Menge entsteht. Der -Wert von Ammonium beträgt basierend auf dem -Wert von Ammoniak Daraus folgt: Der pH-Wert der Pufferlösung liegt daher bei ungefähr was zeigt, dass die Lösung leicht basisch ist.

Diagramm zur Stoffmenge des hydrolysierten Substrats Berechnung der mittleren Reaktionsgeschwindigkeit Die mittlere Reaktionsgeschwindigkeit im Zeitraum von bis wird berechnet, indem die Änderung der Stoffmenge des hydrolysierten Substrats durch die Änderung der Zeit geteilt wird: Die mittlere Reaktionsgeschwindigkeit beträgt

Diagramm des vermuteten Einflusses der Bowman-Birk-Inhibitoren auf die Trypsin-Aktivität Beschreibung einer experimentellen Vorgehensweise Die Hypothese, dass Bowman-Birk-Inhibitoren kompetitive Hemmstoffe wirken, basiert auf der Annahme, dass die Inhibitoren sich an das aktive Zentrum des Enzyms binden und so die Bindung des natürlichen Substrats blockieren, was die Enzymaktivität reduziert. Um die Hypothese zu überprüfen, könnte der folgende experimentelle Ansatz durchgeführt werden: Eine definierte Menge Trypsin wird in einem Puffer bei gelöst, da dieser pH-Wert optimal für die Enzymaktivität ist. Als Substrat wird eine Substanz verwendet, die bei Spaltung durch Trypsin ein farbiges Produkt freisetzt, das mithilfe eines Photometers gemessen werden kann. Ein Beispiel hierfür ist Benzoyl-Arginin-p-nitroanilid (BAPNA), das bei Spaltung eine gelbe Färbung entwickelt. Es werden mehrere Reaktionsansätze vorbereitet: In einigen wird nur Trypsin mit dem Substrat gemischt, um die normale Enzymaktivität zu messen. In den anderen Ansätzen wird zusätzlich der Bowman-Birk-Inhibitor in verschiedenen Konzentrationen hinzugegeben. Die Farbentwicklung (Reaktionsgeschwindigkeit) wird für alle Ansätze gemessen. Wenn der Bowman-Birk-Inhibitor kompetitiv hemmt, sollte die Reaktionsgeschwindigkeit bei Zugabe des Inhibitors geringer sein als ohne Inhibitor. Diese Hemmung zeigt sich insbesondere bei niedrigen Substratkonzentrationen deutlich, während bei sehr hohen Substratkonzentrationen die Hemmung aufgehoben wird, da das Substrat mit dem Inhibitor um die Bindung an Trypsin konkurriert. Die Ergebnisse können in einem Diagramm dargestellt werden, in dem die Reaktionsgeschwindigkeit gegen die Substratkonzentration aufgetragen wird. Eine Verschiebung der Kurve bei Zugabe des Inhibitors nach rechts zeigt die typische kompetitive Hemmung.