Um Lactoperoxidase von anderen Milch-Proteinen wie dem -Casein zu isolieren, bedarf es eines Trennverfahrens, wie z. B. der Elektrophorese. Diese eignet sich, da sich nicht nur für einzelne Aminosäuren, sondern auch für Proteine isoelektrische Punkte (IEP) bestimmen lassen.

Im Protein -Casein findet sich in der Primärstruktur ab Position die Aminosäuresequenz Zeichne mithilfe der Tabelle 2 einen Strukturformelausschnitt für diese Aminosäuresequenz.

Leite aus Tabelle 1 für die beiden Proteine Lactoperoxidase und -Casein jeweils ihre Wanderungsrichtung während einer Elektrophorese bei pH-Wert ab.
Erkläre mithilfe von Tabelle 2 den Zusammenhang zwischen den isoelektrischen Punkten von Lactoperoxidase bzw. -Casein und deren Aminosäureanteilen.

Das Enzym Lactoperoxidase katalysiert die Bildung der antibakteriell wirkenden Hypothiocyanit-Ionen durch Reaktion von Thiocyanat-Ionen und Wasserstoffperoxid-Molekülen Das Reaktionsschema dieser Reaktion ist in Abbildung 1 dargestellt.

Formuliere mithilfe der in Abbildung 1 angegebenen Oxidationszahlen die Redoxteilgleichungen der Bildung von Hypothiocyanit-Ionen und Wasser-Molekülen durch Reaktion von Thiocyanat-Ionen mit Wasserstoffperoxid-Molekülen im sauren Milieu.

In einer Versuchsreihe wird die enzymatische Bildung von Hypothiocyanit-Ionen in Abhängigkeit von der Wasserstoffperoxid-Konzentration untersucht.
In allen Versuchsansätzen wurden die gleichen Enzymmengen eingesetzt und Thiocyanat-Ionen im Überschuss zugegeben. Nach jeweils der gleichen Zeit wurde die Reaktion gestoppt. Anschließend wurde die Konzentration der Hypothiocyanit-Ionen bestimmt.
Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der Versuchsreihe. Stelle eine Hypothese zu den erwarteten Messergebnissen bei höheren Wasserstoffperoxid-Konzentrationen auf. Zeichne einen entsprechenden Graphen in Abbildung 2 ein.

Um den antibakteriellen Effekt der Lactoperoxidase zu untersuchen, sollen Bakterien in einem Medium mit kultiviert werden. Zur Herstellung eines geeigneten Puffers stehen Lösungen von Phosphorsäure, Natriumdihydrogenphosphat, Natriumhydrogenphosphat und Natriumphosphat mit einer Konzentration von jeweils zur Verfügung. Leite mithilfe von Tabelle 3 die geeigneten Lösungen zur Herstellung einer Puffer-Lösung mit ab. Berechne das Konzentrationsverhältnis des korrespondierenden Säure-Base-Paares in der Puffer- Lösung.

Um Milch länger haltbar zu machen, kann diese pasteurisiert werden. Bei der klassischen Pasteurisierung wird Milch für einen Zeitraum von bis Sekunden auf eine Temperatur zwischen und erhitzt. Lactoperoxidase wird bei Erhitzung auf schon nach vier Sekunden dauerhaft inaktiviert.

Erkläre anhand einer Modellvorstellung die Inaktivierung der Lactoperoxidase bei zu starkem Erhitzen.

Lactoperoxidase (LP) setzt auch farbloses Tetramethylbenzidin (TMB) zu blau gefärbtem Benzidinblau um. Zwei Milchproben A und B werden pasteurisiert. Mit den in Tabelle 4 dargestellten Versuchsansätzen soll festgestellt werden, ob diese Proben überpasteurisiert, d. h. beim Pasteurisieren zu hoch erhitzt wurden. Aufgrund der Beobachtungen werden folgende Hypothesen aufgestellt: Prüfe die aufgestellten Hypothesen auf ihre Richtigkeit.
Erkläre die Bedeutung der Versuchsansätze 3 und 4.

Strukturformelausschnitt der Aminosäuresequenz

Wanderungsrichtung der beiden Proteine Der isoelektrische Punkt (IEP) von Lactoperoxidase ist bei und damit größer als der pH-Wert von bei der Elektrophorese. Damit liegt sie in kationischer Form vor und wandert zum Minuspol.
Im Gegensatz dazu liegt Casein hier in anionischer Form vor, da der pH-Wert über dem IEP von liegt. Demzufolge bewegt es sich unter diesen Bedingungen zum Pluspol des Stromkreises hin. Zusammenhang zwischen den isoelektrischen Punkten Der IEP ermöglicht die Bestimmung, ob Teilchen bei einem gegebenen pH-Wert als Kation, Anion oder neutral geladen vorliegen. Der IEP eines Proteins hängt vom Verhältnis der Aminosäuren mit zusätzlichen Carboxyl- bzw. Aminogruppen in den Seitenketten ab. Aufgrund des höheren Anteils basischer Aminosäuren wie Lysin und Arginin im Vergleich zu sauren Aminosäuren wie Glutamin- und Asparaginsäure weist Lactoperoxidase einen höheren IEP als Casein auf.

Formulierung der Redoxteilgleichungen

Hypothese zu den erwarteten Messergebnissen Die Enzymaktivität der Lactoperoxidase steigt mit zunehmender Konzentration von Wasserstoffperoxid, da mehr aktive Zentren durch das Substrat besetzt werden. Jedoch kann die Enzymaktivität nicht weiter gesteigert werden, wenn alle aktiven Zentren der Lactoperoxidase-Moleküle belegt sind. Daher erreicht die Bildung von Hypothiocyanit-Ionen bei höheren Wasserstoffperoxid-Konzentrationen ein Maximum.
Die Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration folgt einer Sättigungskurve:

Ableitung geeigneter Lösungen Die Puffer-Lösung soll einen pH-Wert von haben. Da der optimale Pufferbereich einer gelösten Säure und ihrer korrespondierenden Base bei liegt. Demnach ist als Pufferlösung am geeignetsten. Berechnung des Konzentrationsverhältnisses Zur Berechnung des Konzentrationsverhältnisses des korrespondierenden Säure-Base-Paares wird die Henderson-Hasselbalch-Gleichung verwendet: Das Konzentrationsverhältnis des korrespondierenden Säure-Base-Paares in der Puffer-Lösung beträgt

Erklärung der Inaktivierung Die Lactoperoxidase besteht wie alle Enzyme aus einem Proteinanteil, der die räumliche Struktur des Enzyms bestimmt. Hohe Temperaturen beeinflussen die Tertiärstruktur, indem sie die intramolekularen Wechselwirkungen stören, was zur Denaturierung des Proteins führt. Durch diese Veränderung der räumlichen Struktur kann das Substrat nicht mehr effektiv an das aktive Zentrum des Enzyms binden, wie es im Schlüssel-Schloss-Modell vorgesehen ist. Dadurch wird das Enzym inaktiviert.

Richtigkeit der Hypothesen Bedeutung der Versuchsansätze 3 und 4 Die Versuchsansätze 3 und 4 fungieren als Blindproben. Mit dem 3. Versuchsansatz wird kontrolliert, ob Lactoperoxidase überhaupt TMB umgesetzt wird und mit dem 4., ob die Lactoperoxidase für die Umsetzung überhaupt notwendig ist.