Transgene Organismen
Transgene Organismen sind Organismen, die DNA enthalten, die nicht zum eigenen Genom gehört. Diese DNA wird als
Transgen oder
Fremdgen bezeichnet. Sowohl in der Forschung als auch in der Industrie sind transgene Organismen sehr wichtig. Sie werden beispielsweise verwendet, um die
Genexpression zu verändern oder (durch fluoreszierende Farbstoffe) die Lokalisation bestimmter Proteine sichtbar zu machen. Um ein Fremdgen in einen Organismus einzubringen, wird häufig ein
viraler oder bakterieller Vektor verwendet.
Plasmidvektoren
Vektoren sind
Werkzeuge der Biotechnologie, die es ermöglichen, Fremdgene in Zellen oder Organismen einzubringen.
- Aufbau
Plasmide sind kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die natürlicherweise in Bakterien vorkommen, aber auch künstlich hergestellt werden können. Sie replizieren sich unabhängig vom chromosomalen Genom der Bakterien. Plasmide werden verwendet, um Gene in Bakterien einzuschleusen, damit diese bestimmte Proteine produzieren, wie beispielsweise Insulin. Plasmidvektoren enthalten einen Origin of replication, der für die Replikation des Plasmids in der Zielzelle verantwortlich ist. Ein Antibiotikaresistenzgen dient als Selektionsmarker, der Bakterien resistent gegen ein Antibiotikum wie Ampicillin macht. Die multiple cloning site liegt innerhalb dieses Abschnitts und enthält mehrere Restriktionsschnittstellen für verschiedene Restriktionsenzyme. An diese Stelle kann das Fremdgen in das Plasmid integriert werden. Vor dem Fremdgen befindet sich ein Promotor, der die Expression des Fremdgens steuert. Ein weiteres Resistenzgen ermöglicht die Selektion der positiven Kolonien.
- Einschleusen des Fremdgens
Um das Fremdgen in das Plasmid einzubringen, muss es zunächst mit einem Restriktionsenzym verdaut werden. Dieser Prozess erzeugt Überhänge an den Enden des Fremdgens, die sogenannten sticky ends. Das Plasmid wird mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten, sodass es an einer Stelle offen ist, und ebenfalls Überhänge enthält. Diese sind komplementär zu den Überhängen des Fremdgens. Plasmid und Fremdgen werden zusammengebracht, und durch den Prozess der Ligation wird das Fremdgen in das Plasmid integriert. Das Plasmid mit Fremdgen wird anschließend in Bakterienzellen eingeschleust (Transformation).
- Selektion
Zunächst wird geprüft, welche Zellen ein Plasmid aufgenommen haben. Dazu lässt man die Bakterienzellen in einem Medium wachsen, welches ein Antibiotikum enthält, das die Zellen unter normalen Umständen abtötet. Nur diejenigen Bakterienzellen, die ein Plasmid aufgenommen haben, verfügen über ein Antibiotikaresistenzgen, das ihnen erlaubt, auf dem Medium zu wachsen. Es kann jedoch vorkommen, dass Zellen zwar ein Plasmid aufgenommen haben, dieses jedoch nicht das gewünschte Fremdgen enthält. Zur Selektion der Zellen, die ein Plasmid mit Fremdgen tragen, wird das Fremdgen in ein weiteres Resistenzgen eingebracht. Ist ein Plasmid nicht rekombinant (trägt also kein Fremdgen), ist das Resistenzgen intakt. Wurde ein Fremdgen aufgenommen, so ist das Resistenzgen unterbrochen. Bakterienzellen mit Fremdgen können auf dem ersten Medium wachsen. Werden sie jedoch mit der Stempeltechnik auf ein Medium übertragen, bei dem ihr (unterbrochenes) Resistenzgen wirkungslos ist, sterben sie. Diese Kolonien können anschließend ausgehend vom ersten Medium weiter vermehrt werden.
