Gentechnische Methoden

Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die PCR ist eine Strategie zur Amplifikation (Vervielfältigung) von DNA oder RNA.

Denaturierung: Die Doppelhelix wird bei einer Temperatur von ca. 90 °C in ihre beiden Einzelstränge aufgespalten. Das liegt daran, dass bei dieser Temperatur die Wasserstoffbrücken zwischen den einzelnen Basenpaaren aufgelöst werden.

Hybridisierung: Hier werden bei 50 bis 65 °C Primer komplementär an die zu vervielfältigenden Abschnitte angelagert.
Polymerisation: Die sogenannte Taq-Polymerase synthetisiert bei 72 °C, ausgehend von dem 3'-Ende des DNA-Primers, einen zum Matrizenstrang komplementären DNA-Strang.
Dieser Zyklus wird so oft wiederholt, bis die gewünschte Menge des zu replizierenden DNA-Abschnitts entstanden ist.

Durch PCR kann mittels des Enzyms Reverse Transkriptase auch DNA aus RNA hergestellt werden, die sogenannte cDNA. Dieses Verfahren wird Reverse-Transkriptase-PCR genannt und funktioniert folgendermaßen:

An den Poly-A-Schwanz der mRNA wird ein komplementärer Oligo-dT-Primer hybridisiert. Das Enzym Reverse Transkriptase synthetisiert ausgehend von diesem Primer den zur mRNA komplementären DNA-Strang (cDNA).
Es entsteht ein Doppelstrang aus RNA und DNA. Mittels des Enzyms RNase kann die RNA aus dem Doppelstrang eliminiert werden.
Die cDNA liegt nun einzelsträngig vor. An diesen Einzelstrang bindet ein PCR-Primer, welcher durch die Taq-Polymerase einen zu der cDNA komplementären DNA-Strang synthetisiert.
Der dadurch entstandene DNA-Doppelstrang dient in einer nachfolgenden PCR als Matrizenstrang. Ausgehend von diesem Strang wird das gewünschte DNA-Fragment vervielfältigt.

Um eine Aussage über die Menge an mRNA in einer Probe machen zu können, wird das Verfahren der quantitativen Realtime-PCR (RT-PCR) angewandt. Der Ablauf ist grundsätzlich identisch zu der gewöhnlichen PCR-Reaktion. Bei der RT-PCR werden allerdings floureszierende Farbstoffe oder Sonden genutzt, um die Menge der amplifizierten DNA in Echtzeit zu messen.

Fluoreszierende Farbstoffe: Diese binden unspezifisch an alle doppelsträngigen DNA-Moleküle. Ein häufig verwendeter Farbstoff ist SYBR Green, der nur in Gegenwart von doppelsträngiger DNA fluoresziert. Beim Einsatz sequenzspezifischer Primer, wird nur die Zielsequenz amplifiziert, und daraufhin ein Fluoreszenzsignal gemessen.

Hydrolyse-Sonden (TaqMan-Sonden): Diese sind spezifisch für eine bestimmte DNA-Sequenz. Die Sonden bestehen aus einem Reporter-Farbstoff und einem Quencher, der das Fluoreszenzsignal hemmt. Während der Polymerisation trennt die Taq-Polymerase den Reporter vom Quencher, wodurch der Reporter zu leuchten beginnt.

Die qPCR-Maschine misst die Fluoreszenz nach jedem Zyklus und erstellt eine Amplifikationskurve. Durch Vergleich der Amplifikationskurve der Probe mit einer Standardkurve bekannter DNA-Konzentrationen kann die anfängliche Menge der Ziel-DNA in der Probe bestimmt werden.

Diese Methode wird verwendet, um das Vorhandensein und die Menge von Viren oder Bakterien in einer Probe nachzuweisen, z.B. bei COVID-19-Tests. Darüber hinaus können Wissenschaftler die Expression bestimmter Gene untersuchen und feststellen, wie aktiv diese Gene in verschiedenen Zelltypen oder unter verschiedenen Bedingungen sind.

DNA-Sequenzierung

Die Sequenzierung wird in vielen Bereichen der Biologie und Medizin eingesetzt. In der Genomforschung dient sie der Bestimmung und dem Vergleich ganzer Genome verschiedener Organismen, um evolutionäre Beziehungen und funktionelle Genomik zu verstehen. In der medizinischen Diagnostik hilft sie bei der Identifizierung genetischer Störungen und ermöglicht die Entwicklung personalisierter Behandlungsansätze, insbesondere in der Präzisionsmedizin. Bei Infektionskrankheiten dient die Sequenzierung der Identifizierung und Charakterisierung von Pathogenen sowie der Überwachung von Epidemien. In der forensischen Wissenschaft unterstützt sie die Identifizierung von Individuen. In der Agrarwissenschaft und Tierzucht verbessert sie Nutzpflanzen und Nutztiere durch das Verständnis genetischer Grundlagen. Schließlich trägt die Sequenzierung in der Ökologie und Evolution zur Erforschung der genetischen Vielfalt und zur Bestimmung evolutionärer Beziehungen bei.

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Name	Beschreibung	Einsatzgebiet
Sanger Sequenzierung	Klassische Methode der DNA-Sequenzierung. Basierend auf dem Einbau von Didesoxynukleotiden, die die DNA-Synthese terminieren.	Kurze DNA-Fragmente
Next Generation Sequencing	Hochdurchsatzsequenzierungsmethoden, die parallel Millionen von DNA-Fragmente sequenzieren. Ein Beispiel ist das Illumina (Solexa) Sequencing.	Ganze Genome
Third Generation Sequencing	Technologien wie Single Molecule Real-Time (SMRT) Sequencing und Nanopore Sequencing ermöglichen die Sequenzierung von Einzelmolekülen ohne vorherige Amplifikation.	Lange Leseweiten und RNA-Sequenzierung.
ChIP-Sequencing	Kombiniert Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), bei der spezifische DNA-Protein-Interaktionen in vivo untersucht werden, indem DNA-Sequenzen, die an bestimmte Proteine gebunden sind, mittels spezifischer Antikörper isoliert und anschließend analysiert werden, mit Sequenzierung.	Untersuchung der DNA-Protein-Interaktionen, insbesondere von Transkriptionsfaktoren und Histonen

Gelelektrophorese

Das Verfahren der Gelelektrophorese dient der Unterscheidung geladener Teilchen (wie zum Beispiel DNA-Fragmente) nach ihrer Größe. Durch eine anschließende Färbung des Gels können diese Fragmente sichtbar gemacht werden. Die Gelelektrophorese besteht aus einer Kammer, in der sich ein Agarose-Gel befindet. Das Gel ist strukturell wie ein engmaschiges Netz aufgebaut, wodurch größere Fragmente langsamer wandern als kleinere. Auf der Kathodenseite des Gels werden die zu untersuchenden Proben gemeinsam mit einem Ladepuffer in dafür vorgesehene Taschen im Gel gegeben. In der Regel wird in eine äußere Tasche ein Größenmarker gegeben, um die DNA-Fragmente später zuordnen zu können.

Im Anschluss wird eine elektrische Spannung angelegt, und die Fragmente beginnen zu wandern. Da die DNA polar und durch ihr Phosphatrückgrat negativ geladen ist, wandert sie im Gel von der Kathode in Richtung Anode. Nach einer definierten Zeitspanne wird das Gel von der Spannungsquelle getrennt, und mit einem Farbstoff eingefärbt, der die Banden im UV-Licht sichtbar macht. Dadurch und durch den Vergleich mit dem Größenmarker kann die Länge und Häufigkeit der erhaltenen DNA Fragmente ermittelt werden.

CRISPR-Cas

CRISPR-Cas ist eine bahnbrechende Gentechnologie, die es ermöglicht, DNA präzise und effizient zu schneiden und zu modifizieren. Sie wird in der Genomeditierung eingesetzt, um spezifische Genveränderungen vorzunehmen, genetische Erkrankungen zu behandeln und Genfunktionen zu erforschen. In der Landwirtschaft verbessert die Technologie Eigenschaften von Nutzpflanzen durch das Einbringen nützlicher Gene, während sie in der Biotechnologie Mikroorganismen für industrielle Anwendungen optimiert. In der Medizin wird CRISPR-Cas zur Entwicklung von Immuntherapien und zur Bekämpfung viraler Infektionen genutzt. Die Technik zeichnet sich durch ihre hohe Präzision, Effizienz, Vielseitigkeit, Kostengünstigkeit und breite Anwendungsmöglichkeiten aus, was sie zu einer wichtigen Methode in der modernen Wissenschaft macht.

Das CRISPR-Cas-System dient in der Natur als immunologisches Gedächtnis von Bakterien, indem es DNA-Fragmente von Viren, die das Bakterium infiziert haben, speichert. Bei einer erneuten Infektion erkennt das System diese Sequenzen und aktiviert Cas-Proteine, um die virale DNA gezielt zu schneiden und zu zerstören. Diese adaptive Immunität ermöglicht es Bakterien, sich effizient gegen wiederholte virale Angriffe zu verteidigen. Dieser Prozess bildet die Grundlage für die Anwendung von CRISPR-Cas in der Genomeditierung.